SCS【6】单细胞转录组之细胞类型自动注释 (SingleR),单细胞数据分析流程（cellranger、Seurat、singleR）

SCS【6】单细胞转录组之细胞类型自动注释 (SingleR)

单细胞转录组数据的细胞类型注释是单细胞研究中的关键环节。这个过程大致可以分为人工注释和软件自动化注释两种方法。

人工注释需要研究者查阅文献，寻找marker基因，并结合已有的注释数据库，如cellMarker，PanglaoDB，CancerSEA等。这种方法的优点是准确性较高，但对研究者的背景和精力要求较高。

另一方面，软件自动化注释则相对简便，主要是使用内置数据集进行注释。不过，它的准确性可能会稍差一些，但它可以作为一种辅助注释手段。

自动化注释的软件中，singleR是一个常用的包，它基于已知类型标签的细胞样本作为参考，对测试数据集中的细胞进行标记注释。singleR自带7个参考数据集，涵盖人和鼠的多个样本类型，如BlueprintEncodeData、DatabaseImmuneCellExpressionData、HumanPrimaryCellAtlasData、MonacoImmuneData、NovershternHematopoieticData等。

为了演示singleR的基本功能，本文使用了Seurat 4.0数据集。首先，通过运行函数完成数据读取和三种降维聚类方法的计算（PCA, UMAP, TSNE）。接着，加载了两个与人类相关的单细胞类型数据库，并分别对单个数据库和多个数据库进行注释。

注释结果的诊断涉及细胞得分、delta值和与聚类结果的比较。准确的结果通常表现为细胞在一个标签得分显著高于其他标签，而delta值低则表示注释结果不够明确。

掌握单细胞分析后，将有助于简化研究过程，并且随着测序费用的降低，单细胞分析已成为科研领域的有力工具。如果您需要相关服务，欢迎联系桓峰基因，提供最高端的科研支持。

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单细胞测序实用工具：细胞类型注释，这一篇就够了

细胞类型注释在scRNA-seq数据分析中扮演关键角色。传统方法需先聚类细胞，再根据典型差异表达基因进行注释，这一过程耗时且依赖先验知识。相比之下，自动注释工具具有快速简洁的优点。这类工具大致分为三种类型：基于Marker基因的注释、基于参考转录组的注释、以及使用监督学习方法。接下来，我们将探讨三种常见自动注释工具——CellAssign、SingleR、以及CellTypist。

CellAssign是一种基于概率图模型的方法，它利用预先设定的Marker基因知识，通过推断细胞类型概率将未知数据分配到不同的细胞类型。这种方法在准确性和F1得分方面表现更佳，并能有效控制批次效应和样本效应。

另一个工具SingleR，通过将未知细胞的基因表达与参考数据集中的已知细胞类型进行相关性分析，确定每个单细胞的细胞类型。其注释过程包括独立注释每个单细胞、整合相关系数并去除最低相关性值的细胞类型，直至只剩下两个细胞类型为止。SingleR自带参考数据集，用户可进行注释操作。

CellTypist是一个用于自动注释人类组织中免疫细胞的工具，它整合来自不同组织的细胞数据，使用机器学习方法训练模型实现细胞类型的准确分类。该工具在不同细胞类型分类上的准确性达到约0.9，能识别包括T细胞、B细胞、单核巨噬细胞在内的不同细胞亚群。CellTypist既可以作为注释工具使用，也可以作为免疫细胞数据库。用户可通过命令行、Python环境或在线分析平台进行注释。

自动注释工具依赖于参考数据，且结果可能因所选参考数据的不同而变化。因此，在选择参考数据时需格外谨慎。注释工具还可分为细胞基于和簇基于两种类型，注释到单个细胞或簇。注释结果的准确率随参考数据中每种细胞类型的数量增加而提高。当参考数据中某一细胞类型数量较少时，使用单个细胞的注释方法可能不再适用。

不同研究给出了不同的结论，表明自动注释工具整体表现最好，但重要的是选择参考数据的质量以及与待注释样本的匹配性。Zoe A. Clarke等人建议的步骤包括：首先尝试使用自动注释方法，以快速进行细胞注释；若结果不准确或存在冲突，则进行手动注释；最后，对注释结果进行独立验证。

综上所述，自动注释工具在scRNA-seq细胞类型注释中发挥了重要作用。选择合适的工具和参考数据，结合自动和手动注释方法，可以提高注释结果的准确性。在进行细胞类型注释时，需考虑工具的性能、参考数据的质量以及与样本的匹配性。

图好看易上手！没有比它更适合小白入手的单细胞分析了！老实讲，这操作很sao！

大家好，面对单细胞分析，尤其是对于初学者来说，SingleR是一个理想的入门工具。手动注释尽管精准，但耗时费力。尤其在大量细胞亚群处理中，操作流程可能变得繁琐。这里介绍的是SingleR，一个在R包中的经典工具，用于高效注释scRNA-seq数据。

教程基于bioconctor官网SingleR包文档，目标是提升SingleR的普及度，简化scRNA-seq细胞注释过程。在数据量激增的今天，找到一致且高效的注释方法是挑战。手工注释虽然直观，但耗时且主观性强，限制了亚群的精细区分。SingleR通过指定参考数据集，如已知细胞类型的数据，对未知数据进行注解，其步骤包括构建marker基因集合、计算相关性系数、注释和诊断结果。

SingleR的核心原理是利用marker基因减少干扰，通过比较测试数据的基因表达与参考数据中的标记基因，将测试数据归类到最相似的细胞类型。如果存在多个相似选项，SingleR会通过逐步缩小范围和微调策略确定注释结果。注释结果的诊断通常通过可视化，如相关性矩阵或delta值分析，确保注释的准确性。

实践SingleR时，需要注意包的安装可能不易，但可以尝试多次。选择合适的参考数据集至关重要，同时，使用scRNA-seq包内的数据作为参考也是一种策略。SingleR适用于任何归一化后的数据，如Seurat对象。通过saveRDS和readRDS函数处理大型数据集，确保注释信息的完整。

教程详细介绍了注释流程，包括查看参考数据集的细胞注释信息，比较亚群和注释标签，以及如何在可视化中展示注释结果。此外，作者强调了选择标签的策略，注释后的标签层次，以及如何处理不可比较的字符数据。SingleR是一个工具，需要根据具体需求进行主观判断和选择。

最后，本文提供了fetchData函数的用法，以及如何利用因子水平进行分组比较。对于降噪处理和绘图细节，作者建议根据需求灵活处理。单细胞分析的进一步内容，如提取命令，将在下期继续探讨。

单细胞/单细胞核数据细胞自动化注释

在单细胞分析中，细胞注释是关键且耗时的任务

目前，我们可以通过多种数据库和自动化工具来简化这个过程

以下是几种常用的数据库资源，包括CellMarker、MCA、HCL、SingleCellBase、Cellxgene Data Portal以及专门针对植物的PlantscRNAdb和PlantCellMarker

在自动化注释软件方面，singleR、sc-type和scMayoMap是主流选项

singleR通过与已知标记样本的比较为新数据集提供自动注解，如Lixiaolei使用SingleR自定义的百创DG1000数据集

celldex包提供对多个细胞类型参考数据集的便捷访问，这些参考数据基于大规模RNA测序或微阵列数据，支持不同分辨率的注释

例如，HPCA和Monaco immune data分别提供了免疫细胞和骨髓细胞的高分辨率注释

sc-type利用标记基因选择计算，ScTypeDB_full

xlsx是内置的参考数据库

scMayoMap则基于FindAllMarkers的结果，需要提供组织类型信息以提高准确性

通过比较这些工具在pbmc数据上的注解性能，研究人员可以根据项目需求选择合适的自动化注释方法

单细胞数据分析流程（cellranger、Seurat、singleR）

单细胞数据分析流程主要涉及从数据下载到结果解读的多个步骤。以下为详细步骤：

数据下载步骤可参考简书的教程，下载自己所需的单细胞测序数据。数据文件命名规则为：[样本名称]_S1_L00[读取序列编号]_[读取类型]_001.fastq.gz。数据中的Barcode标记细胞，UMI标记mRNA。

数据质量控制利用FastQC软件进行。已安装FastQC后，通过编写脚本运行该软件，以检测数据质量。通常，使用FastQC检查数据文件质量，确保后续分析的准确性。

使用cellranger软件进行数据分析。首先，安装cellranger并下载参考基因组。参考基因组下载步骤在10x Genomics官方支持页面找到。建议使用官方提供的索引文件以避免可能的错误和节省时间。

cellranger软件提供多种功能，包括：

cellranger mkfastq：用于转换原始测序数据（BCL格式）为FASTQ格式。

cellranger count：将FASTQ文件与参考基因组进行比对，生成下游分析所需的定量数据文件，包括一个.cloupe文件（用于Loupe浏览器分析）和其他下游分析所需的文件格式。

cellranger aggr：用于合并两组数据。

cellranger reanalyze：允许设置不同参数重新分析cellranger count或cellranger aggr的结果。

cellranger multi：用于处理Cell Multiplexing数据集。

细胞定量使用cellranger count，为Seurat分析准备数据。通过编写脚本，使用cellranger count命令执行分析，输出结果文件包括barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz和matrix.mtx.gz。

Seurat分析流程如下：

过滤数据，生成小提琴图，有助于确定后续分析的阈值。

绘制nCount_RNA、nFeature_RNA、percent.mito等关系图，进行数据标准化，选取前十个高变基因。

进行PCA降维，绘制热图，确定数据集的维度。手肘图帮助确认最佳降维数量。

使用UMAP非线性降维，对比UMAP与t-SNE方法在不同样本大小下的效果。

标记和分析每个簇，报告显著差异基因。

使用singleR进行注释，绘制结果图。

进行单细胞轨迹分析。

以上步骤是单细胞数据分析的基本流程，确保每一步操作正确无误，以获得准确且有意义的分析结果。注意管理数据量，确保分析过程的稳定性和效率。